报告基因细胞-自噬过程的可视化工具

自噬通过溶酶体将胞浆物质降解，是维持恒定程序的基本要素。研究自噬潮（autophagicflux）的关键蛋白是LC3（微管相关蛋白1轻链3）。在分离膜形成时胞浆中的LC3被招募并进入自噬程序，此定位动作被视为自噬膜的特征，用以检测自噬的生成和发展。由LC3B融合一个绿色荧光蛋白（GFP）和一个红色荧光蛋白（RFP）组成的嵌合蛋白 ，是检测自噬过程的简单方法。自噬体的形成可被RFP-GFP-LC3标记，显示RFP和GFP双信号。与溶酶体融合后，酸性环境可显著降低GFP信号，RFP信号却保持稳定。随着自噬研究热度的不断提高，自噬报告基因细胞作为自噬过程研究的工具越来越多的受到广大科研工作者的关注。

InvivoGen对人上皮瘤细胞系Hela、鼠源巨噬细胞系RAW264.7和人源单细胞系THP-1进行基因改造，在人源或鼠源LC3的N末端融合两个荧光蛋白，RFP（酸性稳定）和GFP（酸性敏感），得到了稳定表达RFP:GFP:LC3的报告基因细胞Hela-DiFluo^TMhLC3细胞、RAW-DiFluo^TMhLC3细胞和THP1-DiFluo^TMhLC3细胞。在这些报告基因细胞中，通过荧光显微镜检测绿色GFP-LC3和（或）红色RFP-LC3斑点的呈现状态，实现RFP-GFP搭配实时监测自噬潮的功能。

在自噬的早期，RFP和GFP信号均可被探知，当进入自噬体和溶酶体融合程序，GFP荧光信号消失，只留下可视的RFP荧光信号。GFP-LC3/RFP-LC3阳性细胞和RFP-LC3阳性细胞的比例可用来评估自噬潮的阶段。

Hela-DiFluo^TMhLC3细胞、RAW-DiFluo^TMhLC3细胞和THP1-DiFluo^TMhLC3细胞均有Zeocin^TM抗性。

△图1. 在HeLa-DiFluo hLC3 cells中检测荧光斑点

☆HeLa-Difluo?hLC3细胞被25μM rapamycin 单独处理或25μM rapamycin和 500nM bafilomycin A1（抑制自噬体和溶酶体融合）联合处理。孵育24小时，用2% PFA固定细胞，并用共聚焦显微镜分析结果。请注意在图片viii中，黄色（自噬体）和红色（自噬溶酶体）斑点均显著提升，而图片ix中的斑点几乎均为黄色（自噬体）。

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InvivoGen 1977年成立于法国，是法国较早的生物科技公司。公司成立的初期阶段主要提供细胞培养相关试剂，如抗支原体、细菌、真菌污染的抗生素以及基因筛选抗生素（Blasticidin, Puromycin, Hygromycin B, G418, Zeocin）。随着天然免疫研究热点的兴起，InvivoGen于2000年开始致力于天然免疫相关产品的研发和生产，并成为全世界优质、专业的天然免疫相关产品生产商。InvivoGen为天然免疫研究提供一整套研究方案，包括不断更新的模式识别受体（PRRs）激动剂和拮抗剂，PRRs报告基因细胞以及天然免疫信号通路的诱导剂和抑制剂等。

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