如何做好逆转录PCR(二)--提高RT-PCR的特异性

念念不忘，必有回响~继如何做好逆转录PCR（一）——影响逆转录的重要因素（往期微信链接）后，小达君又来继续跟您叨叨逆转录PCR那点儿事了——如何提高RT-PCR的特异性。

一、引物选择

cDNA第一链合成的起始可以使用三种不同的方法：随机引物法、oligo（dT）引物法和基因特异性引物法。各种方法的相对特异性影响了合成的cDNA的量和种类,特异性低的引物，合成的cDNA的量会比较大，种类也比较杂。

(一)随机引物法

随机引物是碱基序列具有随机性的寡核苷酸，其长度通常为6个核苷酸，能够与样品中所有类型的RNA结合。当特定的mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝全长序列时，可采用随机引物来拷贝全长mRNA。随机引物法是三种方法中特异性最低的。使用此方法时，体系中所有的RNA分子都充当了合成cDNA第一链的模板，合成的cDNA中96%来源于rRNA。

(二)Oligo(dT)法

Oligo（dT）引物由12-18个脱氧胸腺核苷酸组成，能够与真核mRNA的Poly(A)尾部相结合。这种引物适用于以真核mRNA为模板构建cDNA文库、全长cDNA克隆，不适用于以降解的RNA为模板进行逆转录。由于Poly(A) RNA仅占总RNA 的1-5%， 故这种引物合成的cDNA比随机引物法得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。这种方法比随机引物的特异性高。

(三)特异性引物法

特异性引物法是特异性最高的一种方法，该方法中的引物含有与目标RNA序列互补的寡核苷酸，用此类引物仅合成所需的cDNA。

二、提高逆转录保温温度

较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使两者可以结合。然而，某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。较高的保温温度可以提高特异性，尤其在使用基因特异性引物进行cDNA合成时。

三、使用具有较高热稳定性的逆转录酶

热稳定逆转录酶可以在较高温度下保温，以提高cDNA合成的特异性。举个栗子，如果一个基因特异性引物（GSP）的退火温度为55℃，那么使用AMV或M-MLV在37℃进行逆转录，GSP所带有的特异性就没有完全利用。然而， 某些具有强热稳定性的逆转录酶可以在50℃或者更高的温度下进行反应，这就会消除较低温度时产生的非特异性产物。

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