IHC实验步骤
标本：组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片；细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片
操作步骤：
①石蜡切片制作
1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定12h
2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，70%酒精1天，80%酒精过夜，95%酒精3h，无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2h
3、透明：1:1无水酒精二甲苯45min，二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）各30min
4、包埋：（恒温箱内进行）浸入石蜡，1:1二甲苯石蜡（58℃）45min，石蜡（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）共2.5h，用石蜡（Ⅲ）包埋组织
5、切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5-7μm，的石蜡带
6、贴片：将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上
（洗片：1%HCl浸泡过夜、蒸馏水冲洗、95%酒精浸泡2h后擦干 → 涂胶：防脱剂多聚赖氨酸）
7、烤片：68℃恒温箱内烤片2h
②SP三步法
1、脱蜡：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60min，或60℃恒温箱中烘烤20min，后用二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）浸泡，共25min
2、水化：无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2min，下行至95%、80%、70%酒精（Ⅰ）（Ⅱ）各2min
3、PBS冲洗2-3次，每次5min
4、阻断：3%H2O2去离子水（或80%甲醇）孵育10min，以灭活内源性过氧化物酶活性
5、PBS冲洗2-3次，每次5min
6、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温
7、PBS冲洗2-3次，每次5min
8、封闭：滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20min，甩去多余液体
9、滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1h，或者37℃1h，或者4℃过夜（需在37℃复温45min）
10、PBS冲洗2-3次，每次5min
11、滴加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗40～50μl，室温静置1h，或37℃1h
12、PBS冲洗2-3次，每次5min
13、滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30min-1h
14、PBS冲洗2-3次，每次5min
15、显色：DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度（胞浆呈棕色者判定为阳性细胞）
（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀）
（A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液）
16、自来水冲洗10分钟终止反应
17、复染：苏木精复染2min，盐酸酒精分化
18、自来水冲洗10-15min
19、常规脱水、透明、封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上）、镜检
③结果分析：每张切片选择5个高倍镜视野（400X），应用图像分析系统进行定量灰度扫描后进行分析。
